浙江工商大学考研(浙江工商大学考研科目)

浙江工商大学考研，浙江工商大学考研科目

大黄鱼体色金黄，含有丰富的微量元素、维生素、蛋白质、不饱和脂肪酸，肉质细致滑嫩，深受消费者喜爱，因此大黄鱼的市场需求极大。大黄鱼常因运输工具的颠簸导致死亡，故其常以冷藏方式进行运输和销售。随着冷藏时间的延长，大黄鱼在内源酶作用下发生自溶、脂肪氧化、以及耐冷细菌的繁殖并代谢，导致鱼体腐败和产生臭味变质，这部分适合生存和繁殖的细菌就是水产品贮藏过程中的特定腐败菌。

RNA噬菌体Qβ复制酶的宿主因子Hfq是一种RNA分子伴侣蛋白，亦是一个结构保守的六聚体蛋白，存在于革兰氏阳性和阴性菌。Hfq通过正向和负向两种调控方式，调节细菌的小RNA（sRNA）和信使RNA（mRNA）的碱基配对，从而影响翻译的进程和RNA的稳定性。浙江工商大学食品与生物工程学院的江京洋，韦旭航、冯立芳*等从波罗的海希瓦氏菌SB-19株中鉴定到1个hfq基因，并构建hfq基因敲除株，通过分析细菌的生长速率、群体感应现象、抗逆境能力、致腐能力，旨在为海产品腐败菌的Hfq功能研究和明晰其致腐机制提供理论基础。

1、波罗的海希瓦氏菌SB-19株hfq基因的鉴定与表达规律

在本实验中，经本地BLAST比对后从波罗的海希瓦氏菌SB-19株中筛选到1个Hfq，且其与目前已报道的波罗的海希瓦氏菌完全一致（图1A），与奥奈达希瓦氏菌、腐败希瓦氏菌以及大肠杆菌的Identity值分别为97.8%、98.9%和75.6%，这说明波罗的海希瓦氏菌hfq基因是一个结构保守的基因。

为分析波罗的海希瓦氏菌SB-19株hfq基因的功能，检测其在迟缓期、对数期、稳定期这3个重要的细菌生长阶段的表达水平。由图1B可知，在细菌培养至4 h的延缓期，hfq基因表达水平尚未发生显著变化；在细菌进入对数生长时期第8小时，hfq基因表达水平较起始提高了1 倍；此后hfq基因的表达水平持续升高，直至稳定期第24小时，hfq基因表达水平较起始提高了3.7 倍。

2、hfq基因缺失对波罗的海希瓦氏菌SB-19株生长速率的影响

WT株在30 ℃培养条件下生长迅速，一般在20 h左右即可进入稳定期，其最大比生长速率（μmax）为0.203 7，稳定期的最大细菌数为8.31f0.11（lg（CFU/mL））。hfq基因KO株在30 ℃培养条件下，其生长曲线与WT株接近，只是在对数期的生长速率相对略低，其μmax为0.170 5，稳定期的最大细菌数为8.25f0.12（lg（CFU/mL）），与WT株的细菌密度无显著性差异（图2A）。

在4 ℃低温培养条件下，WT株生长速率显著降低，μmax为0.030 1，但其稳定期的最大细菌数（8.16f 0.13（lg（CFU/mL）））接近于30 ℃培养条件。然而KO株在4 ℃低温培养条件下生长速率更低，其μmax仅为0.010 2，且稳定期的最大细菌数较相同条件下WT株降低了约2个数量级（图2B）。此结果提示hfq基因有助于波罗的海希瓦氏菌SB-19株抵御低温胁迫，即该基因可能参与细菌的抗环境胁迫过程。

3、hfq基因对波罗的海希瓦氏菌SB-19株信号分子分泌和群体感应的影响

在细菌30 ℃培养的最初6 h，WT株和KO株的DKPs生成量非常接近，培养12 h，WT株的DKPs生成量达到（10.46f 0.34）μg/mL，显著高于KO株的（9.21f0.32）μg/mL（图3A）；而此时WT株的细菌数（6.65f0.20（lg（CFU/mL）））也高于KO株（6.41f0.21（lg（CFU/mL）））（图2A），所以WT株与KO株之间DKPs的差异可能是由细菌数量的不同所造成。随着培养时间的延长（18 h和24 h），细菌进入稳定期，此时细菌对DKPs的消耗量大于生成量，培养液中DKPs含量逐渐降低，KO株的DKPs生成量略高于WT株，无显著差异，这说明hfq基因不参与信号分子DKPs的分泌过程。

4、hfq基因对波罗的海希瓦氏菌SB-19株抗逆境能力的影响

与对照组相比，在NaCl暴露条件下，2 g/100 mL NaCl略微促进了WT株和KO株的生长，而随着NaCl质量浓度的提高，WT株和KO株菌株密度均降低，且KO株始终低于WT株（图4A）。

在营养胁迫条件下，当LB营养肉汤添加量为1/2时，WT株与KO株的OD600 nm分别较对照组减少了19.07%与62.87%；随着LB营养肉汤含量的持续降低，WT株与KO株的OD600 nm持续降低，但KO株始终低于WT株（图4B）。

在重金属胁迫条件下，0.05 mmol/L Cu2+不影响WT株的密度，但此时KO株OD600 nm较对照组降低了33.31%；当Cu2+浓度继续升高，WT株也表现出密度降低，只是相同条件下其OD600 nm高于KO株（图4C）。

在消毒剂胁迫条件下，0.1 g/100 mL NaClO不干扰WT株的生长，而此时KO株非常敏感，密度较对照组降低了75.31%；NaClO质量浓度为0.15 g/100 mL时，WT株OD600 nm较对照组降低了60.90%，KO株此时几乎不生长（图4D）。

上述结果表明，Hfq参与了波罗的海希瓦氏菌SB-19株对盐分、营养、重金属、消毒剂等胁迫环境的适应过程，推测其通过影响sRNA与mRNA二者之间的结合来调节抗逆基因翻译或蛋白质降解，从而改变细菌的环境适应能力，hfq基因缺失降低了波罗的海希瓦氏菌SB-19株的抗逆境能力。

5、hfq基因对波罗的海希瓦氏菌SB-19株致腐能力的影响

在4 ℃冷藏条件下，接种WT株和KO株的灭菌鱼汁内TVB-N和TMA含量随着培养时间的延长而持续增加。在培养3 d，接种WT株的鱼汁内TVB-N质量浓度达到（35.55f 3.32）mg/100 mL，超过了30 mg/100 mL的感官可接受阈值；接种KO株的鱼汁在培养第4天时超过此阈值，且其所产生TVB-N含量始终低于同一时期WT株（图5A）。TMA生成规律与TVB-N相似，接种WT株的灭菌鱼汁在相同培养时间始终高于KO株（图5B）；上述TVB-N和TMA含量的变化说明hfq基因缺失后波罗的海希瓦氏菌SB-19株的致腐能力也相应减弱。hfq基因缺失削弱了波罗的海希瓦氏菌SB-19株的致腐能力。

结 论

波罗的海希瓦氏菌SB-19株中存在一个hfq基因，且该基因表达水平随着细菌的生长而升高；在4 ℃培养条件下，与WT株相比，KO株的生长速率明显迟滞且稳定期细菌密度较低，显示hfq基因在波罗的海希瓦氏菌SB-19株的生长对数期和稳定期发挥重要作用。WT株与KO株所分泌信号分子DKPs和AI-2水平接近，可见hfq基因不参与信号分子的分泌过程；然而，KO株却表现为更低的生物被膜形成能力和胞外蛋白酶活性；接种KO株的灭菌鱼汁也产生较少的TVB-N和TMA，说明Hfq正向调控波罗的海希瓦氏菌的群体感应事件，但不参与信号分子的分泌过程。此外，KO株对盐分、营养、重金属、消毒剂等胁迫条件更为敏感，推测Hfq通过影响sRNA与mRNA二者之间的结合来调节抗逆基因的翻译或蛋白质的降解，从而改变细菌的环境适应能力。综上所述，波罗的海希瓦氏菌SB-19株中Hfq是一个全局性调控因子，整体调节该菌的诸多生理活动。本实验为波罗的海希瓦氏菌的基础生物学研究和海产品微生物的致腐机制提供理论基础。

本文《大黄鱼来源波罗的海希瓦氏菌SB-19的hfq基因功能分析》来源于《食品科学》2022年43卷8期135-141页，作者：江京洋，韦旭航，朱军莉，吴敏，冯立芳。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210501-002。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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