华中农业大学研究生(华中农业大学研究生院)

华中农业大学研究生，华中农业大学研究生院

柑橘是世界和我国第一大类水果，但柑橘果实含水量高，营养丰富，在采后贮运、加工过程中极易遭受病原真菌的侵染而腐烂变质，其中指状青霉（Penicillium digitatum）的侵染性最强，对柑橘的危害最为严重，给生产带来巨大的损失。研究与开发具有新型、高效、低耐药性的杀菌剂对柑橘产业的健康发展具有重要意义。

V-ATP酶是一个由多亚基组成的复合物，主要由V1和V0两个结构域组成。其中，V-ATP酶H亚基蛋白（VMAH）主要负责调控复合体V1和V0的组装以及通过水解ATP调控H＋的跨膜运输。

前期研究发现，VMAH是指状青霉V-ATP酶的关键亚基蛋白，在病原菌生长和侵染过程中发挥着重要作用。此外，VMAH亚基蛋白的蛋白结构和氨基酸序列真菌特异性强，作为新型杀菌剂作用靶点具有潜在的研究前景，因此，华中农业大学食品科技学院的闫 等、彭丽桃、杨书珍*等在前期研究的基础上，进一步利用RNA干扰技术和基因过表达技术，研究VMAH在指状青霉生长过程中的生理功能以及作为抑制柑橘绿霉病的药物作用靶点的可行性，为研发适合柑橘采后防腐保鲜的杀菌剂提供支持。

1、VMAH沉默和过表达对正常条件下指状青霉菌丝生长特性的影响

由图1A可知，与同时期的野生株相比，基因沉默株的生长势明显变弱，产孢量显著降低；而过表达株的生长势强于野生株，菌落直径和产孢量均大于野生株。进一步测定菌丝体的生长曲线（图1B）发现，在整个培养过程中，基因沉默株si14的菌落直径始终小于野生株；而过表达株oe12的菌落直径大于野生株。因此，沉默VMAH抑制了指状青霉的生长，而过表达VMAH促进了指状青霉的生长。

2、VMAH沉默和过表达对不同pH值环境下指状青霉生长特性的影响

如图2所示，WT、si14和oe12的菌丝对偏酸和偏碱条件比较敏感，在pH 10的培养基中，菌丝均不生长。在pH 2的培养基中，过表达和野生菌株都有少量的菌丝生长，无明显成球的菌丝体，沉默菌株的菌丝量相对更少，菌丝分散。在pH 8的培养基中，WT、si14和oe12都可以看到球状菌丝，而沉默菌丝球体积较小，呈米粒状，整体密度不大，分散比较明显；野生型相对于沉默菌株，其菌丝球体积偏大，在培养基中分布也比较均匀，密度适中；过表达相对于前者，其菌丝球体积最大，而且菌丝球致密且规则。

3、VMAH沉默和过表达对不同离子胁迫条件下指状青霉生长特性的影响

如图3所示，在6 种金属离子的胁迫环境下，沉默突变株si14对高浓度的Ca2＋、Fe2＋、Cu2＋比较敏感，对Na＋、K＋、Mg2＋不敏感，其中，沉默突变株对高浓度Ca2＋敏感度最高，当Ca2＋达到1 mol/L时，其菌丝的相对抑制率可达90%左右，而且抑制率显著高于野生型和过表达菌株。过表达菌株对高浓度的Cu2＋比较敏感，对其他5 种金属离子不敏感。其中，低浓度的Ca2＋对过表达菌株起轻微促进作用。

4、VMAH沉默和过表达对指状青霉H2O2胁迫环境的影响

如图4所示，用不同浓度的H2O2处理后，其生长状况受到不同程度的抑制，菌落直径随着H2O2浓度的增大不断减小，并且菌丝的产孢量也不断下降，菌落形态没有发生明显变化。从菌丝生长的相对抑制率可以看出低浓度H2O2对野生菌株和沉默菌株的抑制作用较小，无显著差异，而对过表达菌株的相对抑制率较高。随着H2O2浓度的增大，菌丝生长的相对抑制率不断增大，当其浓度为40 mmol/L时，沉默菌株对H2O2更为敏感，其菌丝生长的相对抑制率显著大于野生株，而过表达菌株的相对抑制率明显小于野生菌株和沉默菌株。

5、VMAH沉默和过表达对指状青霉质子泵抑制剂敏感性的影响

由表1可见，相比于野生株，沉默菌株对于除依布硒之外，其他7 种质子泵抑制剂类杀菌剂的敏感性都显著提高；其中沉默菌株对V-ATP酶的专一抑制剂巴佛洛霉素A1的敏感性提高最为显著，其EC50为10.44 µg/mL，仅为野生株EC50（80.11 µg/mL）的13%。过表达菌株对质子泵抑制剂的敏感性显著降低，其中巴佛洛霉素A1的敏感性下降最为显著，其EC50值为172.08 µg/mL，是野生株的2 倍。

结论

综上所述，VMAH在指状青霉的生长、pH值和离子稳态系统的维持、活性氧水平和氧化应激方面发挥着重要作用，作为控制柑橘采后绿霉病杀菌剂的作用靶点值得进一步深入研究。

本文《指状青霉V-ATP酶H亚基蛋白的功能》来源于《食品科学》2022年43卷6期189-194页，作者：闫等，彭丽桃，李杰，杨书珍。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210218-194。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

图片来源于文章原文及摄图网。

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